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    转bak基因抑制培养的人视网膜色素上皮细胞增殖的实验研究         
    转bak基因抑制培养的人视网膜色素上皮细胞增殖的实验研究
    作者:王静  曾… 文章来源:华中科技大学同济医学院附属协和医院眼科 430022 点击数:1664 更新时间:2004/5/25
    目的 建立人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial, RPE)细胞的原代培养体系并传代。在阳离子脂质体介导下,将bak基因转入人RPE细胞中,希望通过诱导人RPE细胞凋亡来抑制其增殖,为增生性玻璃体视网膜病变的防治提供一种新思路。方法 1)采用消化法,从20-35岁意外死亡12小时内的供体眼中获取RPE细胞,以细胞密度5×104/ml接种于50ml培养瓶中,加入含20%新生小牛血清的DMEM/F12,置于370C、饱和湿度、5%CO2的培养箱中培养,1-3天换液一次。待原代细胞铺满融合后,按1:2-3传代。每日倒置相差显微镜观察细胞生长情况,取对数生长期细胞绘制细胞生长曲线。传至第三代时,通过细胞爬片,应用免疫组织化学的方法鉴定培养的细胞;2)构建bak基因的真核表达载体bak/pcDNA3,在阳离子脂质体Dosper介导下将bak/pcDNA3转染至人RPE细胞,用原位杂交法检测bak基因在人RPE细胞中的转染率,用免疫组化法检测bak蛋白在人PRE细胞中的表达;3)免疫组化法检测bcl-2和bak在转染后人RPE细胞中的表达;4)用TUNEL法和流式细胞仪检测bak基因诱导的人RPE细胞的凋亡;5)用细胞生长曲线、MTT法和Ki-67的表达来检测转染bak基因后,人RPE的增生活性。 结果 1)原代RPE细胞胞浆内见大量黑色素颗粒,细胞呈六边形。传代后细胞呈梭形或多边形,色素明显减少,至第三代已基本消失。抗人细胞角蛋白染色的阳性率几乎达100%。从细胞生长曲线可以看出,人RPE细胞的对数生长期在1-4天;2)转染bak基因后,原位杂交结果见转染后第3天阳性率最高,为68.4%,免疫组化结果见转染后第3天阳性率最高,为62.8%;3)转染bak基因后,人RPE细胞bcl-2的表达较转染前显著性降低;4)TUNEL法检测到转染后人RPE细胞的凋亡率为47.4%,流式细胞仪检测到转染后人RPE细胞的凋亡率为35.37%;4)细胞生长曲线和MTT法均可见转染bak基因后,人RPE细胞生长明显受抑制,转染后Ki-67的表达率为42.7%,较转染前显著性降低。 结论 1)体外培养的人RPE细胞具有与其在体相似的形态结构特征;2)阳离子脂质体Dosper能有效地将bak基因转染入人RPE细胞;3)bak基因能诱导人RPE 凋亡从而抑制其增生。
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